比较CRISPR/Cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响

邱梅玉; 张雪梅; 张宁; 徐鑫; 刘明军; 《中国畜牧杂志 》 2024 北大核心 CSCD

摘要：为了构建增强型eGFP（Enhanced GFP）基因CRISPR/Cas9和引导编辑（Prime Editing,PE）相关载体，确定CRISPR/Cas9和PE对eGFP基因的编辑效率，本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析，人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA，构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒；培养293T细胞，利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序，检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型，同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现，eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组；eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组；eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组；Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个（34.73%）,eGFP-CRISPR/Cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个（56.69%）;eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个（36.32%）。本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒，转染后绿色荧光强度均极显著降低，CRISPR/Cas9编辑存在多种编辑形式，而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换，表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑，为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。

关键词： CRISPR-cas9 引导编辑（PE） eGFP基因 FITC-A-Mean Hi-TOM深度测序