文献类型： 中文期刊

作者： 赵莉 ¹ ; 陈皓斐 ² ; 张文宝 ¹ ; 马正海 ³ ; 张壮志 ¹ ; 张旭 ¹ ; 古努尔·吐尔逊 ¹ ; 米晓云 ¹ ; 金映红 ¹ ; 薛晶 ¹ ; 石保新 ¹ ;

作者机构： 1.新疆畜牧科学院兽医研究所

2.新疆疾病预防控制中心免疫规划科

3.新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程国家重点实验宝

关键词： 细粒棘球绦虫;热休克蛋白家族基因Hsp70;抗血清

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2012 年 45 卷 12 期

页码： 2491-2501

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3 mmol.L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg.L-1。Western blotting检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。