科研产出
7个shRNA分子对绵羊BMPR-1B基因的干扰作用分析
《江苏农业学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox 3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒。最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRT-PCR和Western blot检测。结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好。
关键词： BMPR-1B基因 shRNA HEK293细胞 慢病毒
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绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列(1 128bp)与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35μm,显著低于非转化成肌细胞(10.21%和18.5μm)(P<0.05);Re-altime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调(P<0.01)。【结论】成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。
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绵羊Follistatin基因表达及其结构域的功能分析
《生物工程学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：为研究羊Follistatin基因的功能,提取了绵羊卵巢总RNA,通过RT-PCR方法获得羊FollistatincDNA的完整开放阅读框(1038bp)。去除信号肽序列后与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pFSsig-,经大肠杆菌诱导表达获得FSsig-蛋白(66kDa)。通过RT-PCR克隆了包含N端和结构域1的Follistatin突变体(FSN+D1),将FSN+D1片段插入慢病毒载体(pLEX-MCS)构建了pFS-N+D1慢病毒重组表达质粒。在293T细胞中进行慢病毒的包装,再感染绵羊肌肉原代细胞,得到稳定表达FSN+D1的肌肉细胞系,通过细胞生长曲线结果显示稳定表达FSN+D1的肌肉细胞明显比正常肌肉细胞增殖快,且差异极显著(P<0.01),表明绵羊FSN+D1结构域有促进肌肉细胞生长的功能。
关键词： 绵羊Follistatin基因 原核表达 慢病毒 细胞生长曲线
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