文献类型： 中文期刊

作者： 王立霞 ¹ ; 孟庆玲 ² ; 乔军 ³ ; 蔡扩军 ⁴ ; 王登峰; 伍晔晖; 郭晶; 才学鹏;

作者机构： 1.石河子大学动物科技学院

2.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心

3.新疆畜牧科学院兽医研究所

4.中国农业科学院兰州兽医研究所

关键词： 单核细胞增生李斯特菌;核糖核酸酶Rnase Ⅲ;rncS基因;降解活性

期刊名称： 生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2019 年 3 期

页码： 110-116

摘要： 为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响.利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的Rnase Ⅲ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响.结构域分析结果显示,LM-Rnase Ⅲ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应.体外酶活实验表明,Rnase Ⅲ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS的降解活性有所降低(P<0.001);第122位谷氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS降解活性极显著下降(P<0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM Rnase Ⅲ RncS酶活性的关键位点.