科研产出
绵羊Spry4基因的克隆、真核表达及序列分析
《西北农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为探究Spry4在绵羊毛囊发育过程中的作用,以美利奴羊皮肤组织总RNA的反转录产物为模板,采用PCR技术扩增获得Spry4基因全长编码区,并克隆至pCRTMBluntⅡ-TOPT@vector载体进行测序。随后将ToPo-Spry4亚克隆至pcDNA3.0真核表达载体,再经脂质体转染至293T细胞表达,通过Western Blot鉴定表达产物,分析Spry4核酸和氨基酸序列。结果表明,首次克隆获得绵羊Spry4基因编码序列(GenBank登录号KP280032),序列长954bp,编码298个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸同源性达91%以上;预测Spry4蛋白不存在信号肽和跨膜结构域;Western Blot检测显示,重组表达的蛋白分子质量为36ku,与预期一致。
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绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析
《西北农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。
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中国美利奴羊BMP4基因的克隆、序列分析与真核表达
《石河子大学学报(自然科学版) 》 2014
摘要：本实验利用RT-PCR技术获得妊娠105 d胎羊皮肤组织c DNA,PCR扩增获得中国美利奴羊BMP4基因全长编码区序列(CDS),将其克隆到zero PCR@TM-Blunt载体进行测序验证。获得的BMP4基因亚克隆至pc DNA3.1载体,构建绵羊BMP4真核表达载体,经脂质体2000转染293T细胞进行BMP4重组蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。结果表明:中国美利奴羊BMP4基因编码区包含1227 bp,编码409个氨基酸,与其它哺乳动物氨基酸相似性达到92%,其成熟肽羧基末端区域具有TGFβ家族保守区结构。Western blot结果显示,重组蛋白分子量约为47KD,与预期一致,并证实人源BMP4单克隆抗体能够应用于羊BMP4研究。这为进一步的研究奠定了必要基础。
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泰勒焦虫表面抗原Tams1、SPAG1和TaSP基因的克隆与表达
《新疆农业科学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：【目的】以真核表达系统串联表达环形泰勒焦虫表面抗原Tams1、SPAG1和TaSP的高免疫原性区片段,为研究焦虫重组串联蛋白免疫原性奠定基础。【方法】以悬浮培养泰勒焦虫细胞为材料,利用SOEingPCR方法将Tams1、SPAG1和TaSP蛋白高免疫原性区基因通过柔性氨基酸串联嵌合在乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的主要免疫优势区,构建模拟表位-HBc嵌合蛋白真核表达质粒,转染BHK-21细胞,通过Western-Blot检测目的基因表达产物。【结果】Western-Blot分析显示,阳性质粒转染BHK-21细胞裂解产物在硝酸纤维素膜上呈现特异性条带,大小与预期分子量相当;正常BHK-21细胞裂解产物未呈现相应的条带。【结论】重组嵌合蛋白在真核表达系统中成功表达。
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牛杀菌通透性增加蛋白N端在原核和真核细胞中的表达
《石河子大学学报(自然科学版) 》 2012
摘要：比较重组牛杀菌通透性增加蛋白(BPI)N端714bp编码序列的原核和真核表达载体在大肠杆菌和HEK293细胞中的表达,为进一步研究BPI蛋白N端的功能奠定基础。采用RT-PCR方法从牛的外周血中扩增出BPI蛋白N端的714bp基因片段,分别克隆至原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pLEX-MCS后,再分别转化大肠杆菌BL21菌株、感染HEK293细胞进行重组蛋白的表达。Western blotting检测重组BPI蛋白N端在原核和真核细胞中的表达。结果显示:BPI蛋白N端的原核表达载体pGEX-BPI714和真核表达载体pLEX-BPI714导入原核和真核细胞中均得到表达。Western blotting检测显示,重组GST-BPI714融合蛋白在大肠杆菌中仅能低水平表达,且大都以包涵体形式存在;相反,构建的真核表达载体pLEX-BPI714转染到HEK293细胞后,特异的目的蛋白能高效表达。本研究成功构建了牛源BPI714原核表达载体和真核表达载体,重组BPI714在大肠杆菌中表达不稳定,在HEK293细胞中能够稳定表达。
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