科研产出
山羊环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的原核表达及其酶活性分析
《中国兽医科学 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：为了研究山羊环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（gcGAS）的生物学功能，通过构建含gcGAS基因的pET28a-gcGAS原核表达载体，在Rosetta (DE3)表达菌中进行表达，经纯化获得了纯度较高的重组gcGAS蛋白，并测定其酶促活性。结果显示，在优化表达条件下，实现了重组gcGAS蛋白的可溶性表达，其能以ATP和GTP为底物合成了第二信使分子2′3′-c GAMP。结论：原核表达的可溶性重组gcGAS蛋白具有生物酶催化活性，这为后续gcGAS介导的抗病毒天然免疫机制研究及其应用开发奠定了一定的基础。
关键词： 环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 环鸟苷酸-腺苷酸 原核表达 蛋白纯化 酶活性
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驴FBXL3基因在发情期和乏情期各组织表达谱差异及氨基酸特征分析
《黑龙江畜牧兽医 》 2024 北大核心
摘要：为了探究FBXL3基因在驴卵巢、卵泡液和乳腺的表达水平与驴发情期和乏情期之间的关系，试验以德州毛驴为研究对象，利用qPCR方法分析FBXL3基因在发情期和乏情期不同组织中的表达情况，利用生物信息学方法预测FBXL3蛋白质的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、蛋白质相互作用情况、二级结构和三级结构。结果表明：FBXL3基因在发情期卵巢和卵泡液中的相对表达量极显著高于乏情期(P<0.01),乳腺中的相对表达量显著高于乏情期(P<0.05)。FBXL3蛋白有37个酶解位点，属于亲水性蛋白，无跨膜结构域，主要分布在线粒体上，为酸性、不稳定蛋白质；FBXL3蛋白中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占49.30%、2.57%、35.98%和12.15%,与三级结构预测结果一致；SKP1、FBXL13、CRY1、CRY2、PER1、PER2等蛋白与FBXL3蛋白存在相互作用。说明FBXL3基因在发情期和乏情期的表达具有组织特异性。
关键词： 驴 FBXL3基因 表达分析 生物信息学 季节性发情 组织表达谱
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牛G3BP1蛋白的原核表达及其对牛cGAS生物酶催化活性的影响
《中国兽医科学 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：为了探究牛G3BP1(bG3BP1)对DNA识别受体cGAS生物酶催化活性的影响,本研究提取牛血液淋巴细胞中总的RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,克隆出bG3BP1基因全长;随后构建bG3BP1的原核表达载体pET-28a-SUMO-bG3BP1,将其转化至大肠杆菌中进行诱导表达,使用镍亲和层析柱对重组蛋白bG3BP1进行纯化,并切除His6-SUMO标签后再经镍柱纯化;最后将获得的bG3BP1蛋白用于牛cGAS(bcGAS)的体外酶促反应,采用ELISA方法检测酶促合成产率.结果显示,可溶性表达的bG3BP1蛋白促进了 bcGAS的体外酶促反应,提高了第二信使分子2'3'-cGAMP的产率,这为2'3'-cGAMP的大规模生产及应用提供了研究思路和技术方法.
关键词： 牛cGAS 牛G3BP1 原核表达 第二信使分子 酶促反应
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斜带石斑鱼mstn对其肌肉细胞增殖分化及相关基因表达的影响
《中山大学学报(自然科学版)(中英文) 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：斜带石斑鱼Epinephelus coioides是具有较高经济价值的海水鱼,如何促进石斑鱼生产性状改良一直是科学研究的重点之一.肌肉生长抑制素(mstn,myostatin)是调节肌肉生长的重要转化因子.本研究中,Mstn的亚细胞定位表明Mstn在斜带石斑鱼细胞质中呈点状分布.利用酶标仪测定被Mstn重组蛋白刺激肌肉原代细胞1~5 d后的A值,发现实验组细胞生长明显减缓,随着处理时间的增加,细胞活性差异进一步扩大.利用流式细胞仪测定被Mstn重组蛋白刺激的肌肉原代细胞细胞周期,发现实验组细胞周期受阻.用Mstn重组蛋白对肌肉原代细胞进行刺激,通过RT-qPCR检测Mstn重组蛋白对mstn信号通路及下游相关基因的影响,结果表明随着处理浓度的升高,p21、smad3和mrf4 mRNA的表达量也逐渐而上升,其中,smad3和mrf4表达量的上升不存在显著性差异;当处理浓度为100和1000 nmol/L时,p21存在显著性差异;随着处理浓度的升高,myod和myog mRNA的表达量均下降,但myod mRNA下降趋势不显著,myog mRNA显著下降,当处理浓度为100和1000 nmol/L时存在显著性差异.本研究揭示了Mstn定位于斜带石斑鱼GS细胞质;Mstn重组蛋白上调smad3、mrf4的表达,下调myod、myog的表达,来促进细胞的分化;同时Mstn重组蛋白能上调p21的表达,抑制细胞的增殖.本研究验证了Mstn在肌肉发育过程中的生物学功能,为后续深入开展mstn对鱼类肌肉发育的影响研究奠定了基础.
关键词： mstn 斜带石斑鱼Epinephelus coioides 肌肉 表达分析
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苏博美利奴羊皮肤组织中WNT2基因的DNA甲基化与表达量分析
《中国畜牧杂志 》 2020 北大核心
摘要：毛囊是皮肤的衍生物,WNT信号通路是已知与毛囊发育密切相关的通路之一,为研究WNT信号通路中关键基因WNT2的DNA甲基化和基因表达对羊毛性状的调控作用,本研究以周岁苏博美利奴羊为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序法(BSP),并结合前期MeDIP-seq结果检测了WNT2基因在第5外显子及前后100bp处的DNA甲基化模式,通过实时荧光定量PCR法检测WNT2基因在苏博美利奴羊皮肤组织中的表达量.结果显示:WNT2基因在2组中的甲基化水平均较高,且2组的表达水平与DNA甲基化水平变化趋势一致,同时,CpG11位点的甲基化水平与表达量之间呈现显著正相关,该位点可能与羊毛纤维直径有关,表明WNT2基因的DNA甲基化水平对羊毛纤维直径有一定作用.本实验为后期深入研究DNA甲基化对毛囊的影响提供了重要参考,也为该基因的进一步研究提供理论基础.
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马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建
《草食家畜 》 2019
摘要：马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、 青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关.近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大.最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性.为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30.通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定.结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中.通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功.本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础.
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单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达
《江苏农业科学 》 2019 北大核心
摘要：应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性.序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个.同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性.SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础.
关键词： 单核细胞增生李斯特菌 内化素Lmo0549 克隆 分子特征 原核表达
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苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析
《新疆农业科学 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。
关键词： WNT2基因 表达量 转录因子 密码子 系统进化树
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小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的优化及反应活性
《中国微生态学杂志 》 2019 CSCD
摘要：目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白(64.4kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0mmol/L、诱导时间16h。结论原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。
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KAP16基因在苏博美利奴羊毛囊发育不同时期及不同组织中的表达分析
《家畜生态学报 》 2019 北大核心
摘要：此研究旨在探讨KAP16基因在绵羊毛囊中的分子生物学功能.试验采用实时荧光定量PCR方法分析了苏博美利奴羊毛囊发育的2个关键时期(胚胎期65 d和135 d)KAP16基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及皮肤中的表达量.结果显示:在胚胎期65 d中,KAP16基因在心脏、肝脏、脾脏及肾脏中的表达量显著高于其他3个组织(P<0.05);而在胚胎期135 d中,KAP16基因在皮肤中的表达量极显著高于其他6个组织(P<0.01),并且随着毛囊的逐渐成熟,KAP16基因在皮肤中的表达量也逐步增加.试验结果为进一步研究超细型细毛羊毛囊发育提供了理论依据.
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