科研产出
泰勒虫重组抗原Tams1-spag基因原核表达与纯化
《动物医学进展 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为了在低成本的情况下,得到高浓度、高纯度的环形泰勒虫表面重组抗原的融合蛋白,设定表达过程中不同的OD600nm、IPTG浓度与诱导时间,探索最佳表达条件。通过KCl染色法切胶后分别经透析袋电洗脱法与快速离心法回收目的蛋白。对上述试验的蛋白样品进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,在OD600nm=1时加入浓度为1mmol/L IPTG,过夜诱导时,重组蛋白的表达量最大。在KCl染色法切胶回收目的条带的基础上,电洗脱法与快速离心法均能得到同等浓度的高纯度目的蛋白,经Western blot检测重组蛋白的生物活性没有改变,仍具有良好的反应原性。
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绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析
《西北农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。
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小尾寒羊高繁殖力候选基因ESR在同期发情处理过程中的表达分析
《中国畜牧兽医 》 2014 北大核心
摘要：试验选择高繁殖力小尾寒羊为试验动物,采用公认的CIDR结合外源激素处理使其同期发情,与自然发情及乏情的小尾寒羊作对比,利用反转录荧光定量RT-PCR和Western blotting技术研究雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因在卵巢细胞中的表达差异,同时对其启动子区的甲基化岛进行了分析。结果发现,自然发情绵羊和外源激素处理发情的羊在发情表现和时间上无明显差别;在转录水平的检测结果上也无显著性差异(P>0.05);但是它们显著高于在乏情期绵羊卵巢细胞内的表达(P<0.05)。尽管激素处理的同期发情羊卵巢细胞内的ESR蛋白表达量显著高于乏情期绵羊,但是仍然显著低于自然发情期绵羊卵巢细胞的表达(P<0.05)。此外,自然发情和激素处理的绵羊ESR基因启动子区CpG岛甲基化水平分别为0和10.77%,而发情期绵羊ESR基因启动子处于超甲基化状态(92.30%)。以上结果说明,外源激素处理的同期发情小尾寒羊尽管发情表现、时间等与自然发情的绵羊类似,但是ESR基因在蛋白水平上差异显著,且其启动子区CpG岛甲基化水平也存在显著性差异,这也许是目前胚胎移植后着床率低下的原因之一。
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绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达
《Agricultural Science & Technology 》 2014
摘要：[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
关键词： 绵羊 激活素受体IIB基因 序列分析 原核表达
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细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定
《中国病原生物学杂志 》 2014 CSCD
摘要：目的在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin peroxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cDNA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性。结果酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性。结论在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性。
关键词： 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶 毕赤酵母 分泌表达 抗氧化
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中国美利奴羊BMP4基因的克隆、序列分析与真核表达
《石河子大学学报(自然科学版) 》 2014
摘要：本实验利用RT-PCR技术获得妊娠105 d胎羊皮肤组织c DNA,PCR扩增获得中国美利奴羊BMP4基因全长编码区序列(CDS),将其克隆到zero PCR@TM-Blunt载体进行测序验证。获得的BMP4基因亚克隆至pc DNA3.1载体,构建绵羊BMP4真核表达载体,经脂质体2000转染293T细胞进行BMP4重组蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。结果表明:中国美利奴羊BMP4基因编码区包含1227 bp,编码409个氨基酸,与其它哺乳动物氨基酸相似性达到92%,其成熟肽羧基末端区域具有TGFβ家族保守区结构。Western blot结果显示,重组蛋白分子量约为47KD,与预期一致,并证实人源BMP4单克隆抗体能够应用于羊BMP4研究。这为进一步的研究奠定了必要基础。
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绵羊AMH基因的克隆、序列分析与原核表达
《江苏农业学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：旨在克隆绵羊抗苗勒管激素基因(oAMH)的全长编码区序列,并对其序列进行分析。以绵羊的卵泡颗粒细胞全RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照牛的AMH cDNA序列设计兼并引物,对oAMH基因的全长编码区进行T载体克隆并测序,并对其进行生物信息学分析。根据预测的编码区氨基末端260氨基酸对应的序列设计表达引物,构建原核表达载体pET15b-oamh260,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。序列分析结果表明,获得的绵羊AMH基因序列全长1 797 bp(GenBank登录号:KC986978),完整开放阅读框为1 728 bp,共编码575个氨基酸,氨基末端24个氨基酸为信号肽序列,羧基末端区域TGFβ家族保守区,全序列与牛AMH的同源性为95.80%。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达的融合蛋白大小为30 000,与预期蛋白质大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白质为His融合蛋白。以上结果表明该试验成功克隆了绵羊AMH基因的完整编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
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铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆与原核表达
《草食家畜 》 2013
摘要：为建立铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(Exotoxin A,ETA)的原核表达方法,采用PCR技术扩eta基因,将其插入pET-28a载体构建重组质粒pET-28a-eta,并对重组质粒进行双酶切、PCR及测序鉴定。转入BL21(DE3)中诱导表达,检测目的蛋白大小及反应原性,然后进行表达条件的优化及其表达形式检测。结果表明,所扩增eta基因大小为1917 bp,与GeneBank参比序列一致性在98.70%;蛋白分析表明,rETA大小为74 KDa,具有和天然毒素相似的反应原性。目的基因在37℃、0.6 mmol/LIPTG诱导3 h获得最佳表达。该蛋白在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主。该研究为进一步开展ETA的批量纯化提供了前提条件。
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不同羊毛纤维直径细毛羊皮肤组织差异表达基因研究
《畜牧兽医学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：为了筛选不同被毛纤维直径的细毛羊皮肤组织中的差异表达基因,本研究利用Agilent公司绵羊表达谱芯片和Affymetrix公司牛表达谱芯片对不同被毛纤维直径的细毛羊皮肤组织mRNA进行了芯片杂交;运用Sig-nificance Analysis of Microarrays(SAM)法对基因表达谱进行了差异分析;并通过分子注释系统平台(MAS3.0)对差异表达基因进行了功能富集类分析和调控通路分析;通过实时定量PCR对部分差异表达基因进行了验证。芯片试验共检测到267个差异表达的基因,其中上调基因106个,下调基因161个。Kegg和GO分析表明,参与细胞凋亡、增殖及分化、蛋白质代谢、Wnt信号通路以及羊毛角蛋白结构等生物学过程的多个基因表达水平发生了显著变化。所验证的差异表达基因的荧光定量PCR结果与芯片结果基本一致。结果表明,不同被毛纤维直径的细毛羊皮肤组织的基因表达谱存在差别,这些基因的不同表达可能通过改变皮肤毛囊和羊毛分化过程影响被毛纤维直径。这些基因的发现将为进一步筛选影响羊毛纤维直径性状的重要候选基因/分子标记提供研究基础。
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