科研产出
犬粪便中细粒棘球绦虫抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用
《中国生物制品学杂志 》 2017 CSCD
摘要：目的建立简便、特异的检测犬粪便中细粒棘球绦虫抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法以细粒棘球绦虫EdiagA864蛋白为抗原,免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体;利用HRP标记兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体,通过溶解、超声方法处理犬粪便样品;以抗细粒棘球绦虫单克隆抗体2D12作为捕获抗体,HRP标记的兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体为检测抗体,通过棋盘法确定抗体最佳包被浓度、最佳封闭剂、待检粪样最佳稀释比例及酶标抗体最佳浓度。应用建立的双抗体夹心ELISA法对来自长春地区的64份犬粪便样品及来自新疆的8份犬粪便阳性样品进行检测。结果兔抗EdiagA864多克隆抗体的效价为105。建立的双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:抗体包被浓度为1∶50,封闭剂为1%BSA,粪液稀释度为1∶5,酶标二抗稀释度为1∶800。建立的双抗体夹心ELISA法与犬贾第虫和犬蛔虫阳性样品均无交叉反应;检测不同稀释度的粪便液,当稀释至1∶20时,P/N仍大于2;检测6份阳性样品与4份阴性样品的批间和批内变异系数均小于8。用建立的方法检测8份阳性样品的结果均为阳性,64份待检样品的结果均为阴性。结论建立的双抗夹心ELISA方法特异性较强,敏感性较高,重复性较好,为细粒棘球绦虫流行病学调查及诊断提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法。
关键词： 细粒棘球绦虫 双抗体夹心ELISA EdiagA864 多克隆抗体
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包虫病的诊断方法与预防措施概述
《草食家畜 》 2016
摘要：综述包虫病的相关诊断技术和预防措施研究进展。以细粒棘球绦虫的生活史、包虫病的流行现状、包虫病的检测和诊断技术以及包虫病预防与控制等方面的研究进展进行综述。随着新的诊断技术的发展为包虫病的预防和控制奠定了基础,也使得包虫病患者的早期诊断治疗措施有了重大突破:同时包虫病预防疫苗在动物实验中也收到良好的保护效果,驱虫药物的更新与研发更加深入。目前,在中国包虫病大面积高发,国力民力有限,难以付出巨大的投入,也是控制工作中的主要制约因素,探索出简便易行、投入量少、收效快的防控技术措施,也急待解决。
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抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定
《中国生物制品学杂志 》 2016 CSCD
摘要：目的制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并进行鉴定。方法以细粒棘球绦虫Ediag A864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次。末次免疫3 d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型。采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和Hi Trap Protein G HP亲和层析结合法纯化。结果经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体的杂交瘤细胞株:2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为Ig G1,轻链亚型均为Kappa。2D12、3H4腹水效价为2×105,4A6和6E5腹水效价为1×105。纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带。结论本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础。
关键词： 细粒棘球绦虫 EdiagA864蛋白 单克隆抗体 杂交瘤细胞
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细粒棘球绦虫免疫相关抗原基因的筛选及原核表达
《黑龙江畜牧兽医 》 2016 北大核心
摘要：为了筛选获得细粒棘球绦虫的免疫相关抗原基因,试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,并对获得的细粒棘球绦虫特异性基因进行原核表达与鉴定。结果表明:共获得149个阳性噬菌斑,对其进行PCR扩增和序列分析得到与棘球绦虫属相关的基因序列10个,其中有864 bp的开放性阅读框序列;编码288个氨基酸;经NCBI BLAST氨基酸同源性分析,与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列的同源性为92%,是一个未知的新基因,命名为Ediag A864;经原核表达得到大小约为51 ku的重组蛋白,经Western-blot分析具有良好的反应原性。
关键词： 细粒棘球绦虫 cDNA文库 基因筛选 原核表达 免疫相关 同源性分析
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细粒棘球绦虫感染终末宿主检测方法的评价
《畜牧与兽医 》 2015 北大核心
摘要：对细粒棘球绦虫感染家/牧犬常用的检测方法开展比对试验,并予以评估。对人工感染细粒棘球绦虫试验犬含卵粪样在不同时段用饱和蔗糖液(1.28 g/m L)漂浮虫卵,镜检;经化学药物驱虫,收集人工感染试验犬驱虫前、后粪样,流行病学调查中收集的家/牧犬粪样,用粪抗原抗体夹心ELISA检测试剂盒检测,同时,对检出的家/牧犬阳性粪样,再用虫卵漂浮法复检;通过氢溴酸槟榔碱下泻法检查家/牧犬感染细粒棘球绦虫虫体,同时,对下泻犬粪样用粪抗原检测和虫卵漂浮法进行复检。饱和蔗糖液漂浮虫卵最佳时段为2 h,可检出虫卵量与其他时段差异显著(P<0.05);人工感染犬驱虫前、后粪样经粪抗原检测,OD值差异极显著(P<0.01);对12 288份家/牧犬粪样进行粪抗原检测,阳性样品991份,感染率为8.1%(991/12 288),对991份阳性粪样进行虫卵漂浮法复检,检查出54份粪样中含虫卵。经下泻法检查312只家牧犬,其中,262只犬下泻,检查出27只犬感染细粒棘球绦虫成虫;对262份下泻犬粪样进行粪抗原检测,阳性29份;对262份下泻犬粪样用虫卵漂浮法检查,仅14份粪样检出虫卵。犬粪抗原抗体夹心ELISA检测犬感染细粒棘球绦虫可及时区分驱虫前、后感染状况,其更为安全、快捷、准确。
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细粒棘球蚴原头蚴包囊和原头蚴成虫抑制差减杂交文库中差异表达基因的筛选及分析
《畜牧兽医学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：细粒棘球绦虫原头蚴(PSC)具有双向发育的特点,本文旨在利用SSH和生物信息学方法筛选原头蚴包囊(CW)和成虫(AW)特异性的基因。将PSC-CW和PSC-AW双相发育差减cDNA文库的差减PCR产物克隆入pGEM-T载体并测序,利用CAP3sequence assembly在线软件、Blast2GO软件与GenBank数据库对测序结果进行分析,筛选原头蚴成囊和成虫特异性的基因,并探讨这些基因的功能。结果显示:对PSC-CW和PSC-AW文库进行扩增,分别得到280和200个阳性克隆,菌落PCR鉴定结果表明,这些克隆均插入200~1 000bp片段。测序结果显示从PSC-CW和PSC-AW SSH文库中分别得到16和10个特异性基因。其中PSC-CW SSH文库中得到4个出现频率较高的基因,其余12个基因仅出现1次,其中5个为未知基因,已知基因分别编码细胞色素C氧化酶Ⅰ、热休克蛋白70和铁蛋白等功能蛋白质。PSC-AW SSH文库中得到10个基因,其中2个出现频率较高基因,8个基因仅出现1次,4个为未知基因,6个已知基因分别编码基质蛋白1、延伸因子1α和脂肪酸结合蛋白等功能蛋白质。本研究筛选获得原头蚴成囊和成虫发育时差异表达的基因,对这些基因的功能进行分析表明,PSC-CW SSH文库中多是与营养和能量转运功能的相关基因,而PSC-AW SSH文库中多为发育与分化相关的基因,这些基因的差异表达可能与原头蚴处于不同的生长环境和发育方向有关,同时也为棘球蚴病免疫诊断、药物筛选和疫苗研制提供候选基因。
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细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定
《中国病原生物学杂志 》 2014 CSCD
摘要：目的在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin peroxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cDNA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性。结果酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性。结论在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性。
关键词： 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶 毕赤酵母 分泌表达 抗氧化
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新疆兵团昭苏垦区家畜包虫病防控情况调查
《动物医学进展 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：为了解新疆昭苏垦区包虫病防控工作近况,对新疆生产建设兵团农四师76团和77团饲养的家犬和家畜进行包虫病调查。结果表明,两个团场分别饲养犬1 004条和620条,养殖家畜58 253头(只)和64 848头(只);犬感染细粒棘球绦虫感染率为9.76%(98/1 004)和15.98%(81/507);77团家畜感染包虫病感染率26.45%(338/1 278)。
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细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备
《中国畜牧兽医文摘 》 2013
摘要：[目的]克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体.[方法]从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株.通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件.并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白.
关键词： Hsp70基因 细粒棘球绦虫 抗体制备 克隆 热休克蛋白 原核表达载体 IPTG浓度 特异性抗体
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新疆察布查尔县家畜和犬细粒棘球绦虫感染情况调查
《疾病预防控制通报 》 2013
摘要：目的了解新疆察布查尔锡伯自治县家畜包虫病的流行现状和家/牧犬细粒棘球绦虫感染情况。方法2011~2013年在该县家畜定点屠宰场对剖检牛、羊进行肝、肺组织感染棘球蚴(包虫)情况调查,用双抗夹心ELISA法检测家/牧犬粪抗原的细粒棘球绦虫感染情况。结果 2011~2013年犬细粒棘球绦虫阳性率分别为8.75%(21/240)、4.58%(11/240)和5.83%(14/240);2012~2013年家畜细粒棘球绦虫阳性率分别为11.0%(33/300)和19.3%(58/300)。结论 2011~2013年调查结果表明,该县均有家畜感染棘球蚴和犬感染细粒棘球绦虫,存在犬与牛/羊之间循环的传播链;家畜棘球蚴感染率逐年偏高,并且有上升趋势;但犬的细粒棘球绦虫感染率态势不定,提示该地区包虫病防控工作仍需改善和加强。
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