科研产出
包虫病诊断技术与预防疫苗的研究进展
《疾病预防控制通报 》 2013
摘要：目的综述目前包虫病相关研究的进展。方法从包虫病流行现状、细粒棘球绦虫的结构及生活史、包虫病的检测和诊断技术以及包虫病预防疫苗等方面的研究进展进行综述。结果目前,分子生物学和免疫学技术的发展为包虫病诊断新技术的建立提供了机遇,也促使包虫病患者早期诊断技术有了重大突破;包虫病中间宿主预防性疫苗在动物实验中已经能够产生很好的保护效果,但仍需进行大规模的现场试验以推进疫苗早日进入临床。结论彻底消除包虫病的传播还很困难,故在包虫病控制中还应该采取措施抑制终末宿主犬体内细粒棘球绦虫(E.g)成虫虫卵的产生,使用先进的诊断技术,提早发现病原,从而减少地方性包虫病的流行。
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EgM家族蛋白诱导犬免疫应答动态ELISA检测方法的建立
《中国兽医科学 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为建立用重组GST融合EgM家族(EgM9和EgM123)蛋白和GST蛋白免疫的犬血清中由靶蛋白(EgM家族)产生的特异性抗体的检测方法,用GST融合EgM9和EgM123蛋白及GST蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂分别免疫试验犬3次,100μg/只,并设GST蛋白组和PBS组为对照。三免后第2周,用羊源原头蚴进行口服感染,25 000枚/只,每周采血直至感染后第45天,以GST融合EgM9和EgM123蛋白包板,用中和反应处理血清中由GST蛋白和大肠杆菌产生的抗体,之后用间接ELISA和Western-blot方法检测血清中IgG、IgM和IgA的水平。结果显示,预处理的犬血清能去除GST蛋白和大肠杆菌诱导的抗体。二免后IgG和IgM水平达到峰值,IgG应答水平随免疫和感染仍能保持高应答水平。三免后IgG应答水平未提高。第三次免疫后IgM应答水平逐渐下降。IgA产生低的免疫应答,随免疫刺激和感染没有显著的变化。结果表明,EgM9和EgM123靶蛋白免疫犬能产生高水平的免疫应答,说明用吸收非特异性抗体监测特异性抗体的方法是可行的。
关键词： 细粒棘球绦虫 重组GST融合EgM家族(EgM9、EgM123)蛋白
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犬细粒棘球绦虫粪抗原夹心ELISA检测方法的建立
《动物医学进展 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为建立特异性和敏感性高的检验犬细粒棘球绦虫感染的方法。用细粒棘球绦虫(简称,Eg)成虫抗原分别免疫兔和绵羊,收集高免血清,纯化的高免抗体。依据抗体夹心ELISA工作原理,以兔抗体包被,检测感染Eg、不同犬带科绦虫的实验犬和空白犬粪样,绵羊抗体扑捉抗原,HRP标记兔抗绵羊IgG(1∶8 000)催化显色,用酶标仪测定OD 405nm吸光度,用以确定其特异性和敏感性。试验结果表明,敏感性为82.69%(43/52),特异性为85.88%(140/163);粪抗原在感染细粒棘球绦虫16d后可检出,最低抗原浓度为9.7ng/mL即犬感染5条成虫时可检测出阳性。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,为进一步研制检测细粒棘球绦虫虫体抗原ELISA检测试剂盒奠定了基础。
关键词： 细粒棘球绦虫 粪抗原 双抗夹心ELISA 特异性 敏感性
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细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备
《中国农业科学 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3 mmol.L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg.L-1。Western blotting检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。
关键词： 细粒棘球绦虫 热休克蛋白家族基因Hsp70 抗血清
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细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性分析
《中国农业科学 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物,经蛋白酶K消化,离心上清作为粗提表膜糖抗原,SDS-PAGE鉴定糖抗原成分,硫酸-蒽酮法测定多糖浓度,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现,表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解;制备的糖抗原浓度为2.54mg.mL-1,初步确定为糖抗原。ELISA结果显示,随着免疫次数增加,抗血清中特异性抗体(IgG、IgM和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比,IgG、IgM和IgA的P/N值分别为4.9、3.2和6.4。未检测到特异性IgE。Wenstern-blot检测结果显示,抗血清与原头蚴粗提虫体蛋白、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白、表膜糖抗原有效识别。IFA显色结果显示糖抗原在细粒棘球绦虫虫体表膜中有表达。【结论】经蛋白酶K消化后提取的细粒棘球绦虫表膜糖抗原具有良好的的免疫原性和免疫反应性,有望用于包虫病的诊断和免疫。
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细粒棘球绦虫高免动物血清的特异性和敏感性分析
《草食家畜 》 2011
摘要：目的获得用于诊断细粒棘球绦虫成虫感染时特异性和敏感性高的抗血清。方法用细粒棘球绦虫成虫抗原免疫兔2只,制备高免血清,血清用饱和硫酸铵沉淀、透析、获得比较纯化的抗体,测量浓度和效价后,3μg/ml兔抗体包被,检测感染了不同犬带科绦虫的实验犬和空白犬粪样,单克隆抗体补捉抗原(1∶6000),再用HRP标记的兔抗小鼠IgM(1∶2000),OD 405nm读值,用以判定兔高免血清的特异性和敏感性。结果高免血清抗体效价均为16万,其敏感性为85%(34/40),特异性为87.5%(42/48)。结论此高免血清可以用于建立高敏感性和高特异性的诊断细粒棘球绦虫成虫感染的ELISA方法的建立和优化。
关键词： 细粒棘球绦虫 高免血清 粪抗原 夹心法-ELISA
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细粒棘球绦虫幼虫——原头蚴感染比格犬(Beagle)试验
《中国兽医学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：以比格犬为实验动物经口感染原头蚴,观察细粒棘球绦虫的感染情况。6只比格犬分为3组,每组2只,每组感染原头蚴的剂量分别为5万、15万、25万枚/只,感染后40d开始检查粪便有无虫卵排出。结果显示:人工感染原头蚴后48d虫体开始排卵;6只比格犬(Beagle)细粒棘球绦虫人工感染率为100%,其中5万枚组感染的平均荷虫3457条(成熟2074条,未成熟1383条);15万枚组感染的平均荷虫6230条(成熟3639条,未成熟2591条);25万枚组感染的平均荷虫16238条(成熟11856条,未成熟4382条)。结果表明,比格犬(Beagle)可以成为感染细粒棘球绦虫研究的动物模型。
关键词： 细粒棘球绦虫 比格犬(Beagle) 原头蚴
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EgM9免疫犬产生抗体变化规律的观察
《中国人兽共患病学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：目的用重组表达蛋白EgM9免疫实验犬,观察免疫犬的抗体变化及EgM9的免疫效果。方法用100μgEgM9及5mg的GST并辅以佐剂QuilA分别免疫实验犬,定期收集血清,以间接ELISA法检测血清中IgG及其亚类、IgM、IgA与IgE;感染45d后剖检实验犬,统计犬体内虫体数量。结果免疫组和对照组血清IgG与IgA差异显著(P<0.05);而IgG1与IgG2免疫组和对照组差异极显著(P<0.01);IgM与IgE免疫组和对照组无显著差异(P>0.05);相对于对照组,免疫组的保护率达86%。结论用重组蛋白EgM9免疫犬后能产生很高的抗体水平,可以抑制细粒棘球绦虫的发育,EgM9或许有望作为一种有效的候选疫苗成分用于包虫病的防治。
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EgM9蛋白免疫犬肠系膜淋巴结中抗体的免疫荧光组织化学定位
《中国兽医科学 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：以EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬及感染原头蚴犬3个组的肠系膜淋巴结为材料,用FITC标记羊抗犬IgG和羊抗兔IgG,分别采用一步法和三步法免疫荧光技术检测EgM蛋白免疫犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG。结果显示,EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结组织有清楚可见的荧光点,而感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结荧光较弱。两种方法均证明,EgM蛋白免疫犬后在其肠系膜淋巴结中可以产生特异性抗体。
关键词： 细粒棘球绦虫 原头蚴 犬 抗体反应 免疫荧光组织化学
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细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆
《中国动物传染病学报 》 2009
摘要：为筛选细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究。以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析。ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Western blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原。筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1~2kb之间。对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%。筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因。
关键词： 细粒棘球绦虫 Eg成虫表膜抗原 Eg成虫cDNA文库 免疫筛选 序列分析
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